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摘要：抗体药物偶联物（ADCs）在癌症治疗领域的需求日益增加。尽管半胱氨酸偶联是生产ADCs的常用方法，但由于其异质性，准确测定药物-抗体比（DAR）需要多种分析方法。本文介绍了用于半胱氨酸基ADCs的DAR分析方法，并基于良好生产规范（GMP）的策略生产了一批400毫克用于实验室研究的ADC。该工作评估了几种分析方法，并为未来ADC生产给予了指导，建立了独特的分析策略。

1.引言
近年来，抗体药物偶联物（ADCs）的临床试验显著增加。现在已有超过八十种ADCs处于临床开发中，并已有数种上市。随着这一领域的拓展，分析表征在ADCs的发现、开发和生产中变得更加重要。特别是FDA对基于抗体的生物制药的严格要求，因其化合物的异质性和结构复杂性而给分析工作带来了挑战。多种分析方法已被用于解决这一问题，其中高效液相色谱（HPLC）是表征药物-抗体比（DAR）最常用的方法。针对不同阶段开发多种分析方法以确保DAR测定的准确性至关重要。观测显示，半胱氨酸基ADCs由于其结构复杂性，需要用不同分析方法来解释TCEP依赖性的比较结果。

2.材料与方法
2.1.材料
人IgG1曲妥珠单抗（赫赛汀）和MC-VC-MMAE是分别从瑞士罗氏制药和美国NJ生物制药公司采购的，其他化学试剂则购自Sigma-Aldrich。

2.2.基于GMP策略的半胱氨酸型ADC合成程序
第一时间，将441毫克曲妥珠单抗溶解并缓冲到偶联液中，使用2.35当量的TCEP-HCl在20℃下还原2.5小时。然后加入DMA和6当量的MC-VC-MMAE在20℃下继续反应1小时，接着用N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）终止反应并进一步纯化。

2.3.顺利获得Ellman's assay分析硫醇中间体的实验程序
使用凝胶过滤对还原后的抗体进行纯化，并顺利获得Ellman's assay进行分析。

2.4.仪器/分析方法
顺利获得Solo-VPE系统的斜率光谱法测定蛋白质浓度，HIC和RP-HPLC及SEC分析按照标准方法进行，内毒素检测使用Endosafe-PTS系统完成。

3.结果与讨论
顺利获得一种成熟的方法成功合成了半胱氨酸基ADC。DAR的确定依赖于还原抗体中游离硫醇的水平，TCEP当量对DAR影响最大。在研究中采用了五种不同的TCEP当量进行滴定，并使用Ellman's assay进行进程控制分析来测定游离硫醇含量。顺利获得HIC和RP-HPLC方法对不同TCEP当量制备的ADCs进行了DAR比较，结果表明两者的DAR值稍有差异但趋势一致。

大规模生产ADC时，GMP策略确保了生产过程的规范性和分析方法的有效性。使用良好实验室实践（GLP）要求制备并测试的ADC表现出高DAR值和良好的纯度、浓度、聚集状态及内毒素含量。

4.结论
通过半胱氨酸基结合生产的单批ADC的DAR分析比较成功进行。研究验证了随着TCEP当量的增加DAR的增长趋势。三种分析方法虽然结果略有差异，但整体趋势一致且有用。建议结合多种方法以获得准确的DAR结果。未来研究将继续评估多功能分析方法，以简化和优化ADC的表征分析。

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